Daniel Hoffmann

Produktion des Insektenmetalloprotease Inhibitors in Escherichia coli

Neuartige Plattformtechnologie für die inclusion body-basierte Produktaufarbeitung


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ISBN:

978-3-8440-6677-7

Series:

Schriftenreihe des Institutes für Bioverfahrenstechnik und Pharmazeutische Technologie
Herausgeber: Prof. Dr.-Ing Peter Czermak
Gießen

Volume:

Keywords:

Rekombinante Proteinproduktion; Crossflow-Filtration; Antimikrobielle Peptide; Downstream-Processing; Chromatographie

Type of publication:

Thesis

Language:

German

Pages:

240 pages

Figures:

46 figures

Weight:

356 g

Format:

21 x 14,8 cm

Bindung:

Paperback

Price:

49,80 € / 62,30 SFr

Published:

May 2019

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Abstract

Die Bekämpfung antibiotikaresistenter Krankheitserreger, deren Verbreitung immer weiter zunimmt, könnte zukünftig durch antimikrobielle Peptide (AMPs) gelingen. Insbesondere AMPs aus Insekten sind aufgrund ihrer Diversität vielversprechende pharmazeutische Kandidatenmoleküle. Die potentielle pharmazeutische Anwendung erfordert für entsprechende Charakterisierungen und klinische Studien eine Produktion der AMPs in ausreichenden Mengen und hoher Reinheit. Die rekombinante Proteinproduktion mit Escherichia coli (E. coli) ist im industriellen Maßstab etabliert und kann für kleine Proteine ohne komplexe posttranslationale Modifikationen gut umgesetzt werden. Im Fall der Produktion von AMPs besteht jedoch das Risiko einer toxischen Wirkung des Zielproteins auf den Expressionsorganismus. In dieser Arbeit sollte daher eine Methodik etabliert werden, bei der AMPs in unlöslichen inclusion bodies (IBs) akkumuliert werden, sodass der Expressionsorganismus vor einer eventuellen Toxizität geschützt ist. Außerdem sollte die Produktaufarbeitung der IBs im Vergleich zu klassischen Methoden vereinfacht und möglichst für alle Zielproteine vereinheitlicht werden. Zu diesem Zweck wurde für die IB-basierte Produktion ein pull-down tag verwendet, das durch die Fusion an ein Zielprotein dessen Akkumulation in IBs bewirkt und zugleich eine pH-abhängige Resolubilisierung dieser IBs ermöglicht.
Zum Vergleich der IB-basierten Produktion und Produktaufarbeitung mit einer löslichen Produktion und der entsprechenden Produktaufarbeitung wurde der Insektenmetalloprotease Inhibitor (IMPI) als AMP ausgewählt. Die pH-abhängige Resolubilisierung der IMPI-IBs war möglich und es wurde sowohl nach löslicher, als auch nach IB-basierter Produktion in E. coli bioaktiver IMPI isoliert.