Jan Zitzmann

Prozessintensivierung für die Produktion von antimikrobiellen Peptiden mit stabil transfizierten Drosophila melanogaster S2-Zelllinien


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ISBN:

978-3-8440-6884-9

Series:

Schriftenreihe des Institutes für Bioverfahrenstechnik und Pharmazeutische Technologie
Herausgeber: Prof. Dr.-Ing Peter Czermak
Gießen

Volume:

Keywords:

Rekombinante Proteinproduktion; stabil transfizierte Drosophila melanogaster S2-Zellenantimikrobielle Peptide; antimikrobielle Peptide; Online-Monitoring; Dielektrische Spektroskopie; Trübungsmessung; Prozessintensivierung

Type of publication:

Thesis

Language:

German

Pages:

220 pages

Figures:

57 figures

Weight:

288 g

Format:

21 x 14,8 cm

Bindung:

Paperback

Price:

49,80 € / 62,30 SFr

Published:

August 2019

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Abstract

Antimikrobielle Peptide (AMPs) von Insekten sind wertvolle Ressourcen für die pharmazeutische Industrie und können als Leitstrukturen für die Entwicklung neuartiger Antibiotika dienen. Um dieses Potenzial zu nutzen, ist eine effiziente rekombinante Expression erforderlich. Die Etablierung einer diesbezüglichen Herstellungsplattform umfasst sowohl die Auswahl eines geeigneten Expressionswirts als auch die Prozessoptimierung während des späteren Scale-Ups. Die vorliegende Arbeit beschreibt die rekombinante Herstellung von zwei AMPs, die ursprünglich aus der großen Wachsmotte Galleria mellonella bzw. dem asiatischen Marienkäfer Harmonia axyridis isoliert wurden. Als Expressionswirt wurden stabil transfizierte Drosophila melanogaster S2-Zellen eingesetzt. Basierend auf der polyklonalen Population, die nach der Transfektion vorlag, konnten mittels Limiting Dilution hochproduktive Einzelzellklone isoliert werden, welche typischerweise eine zwei- bis sechsfach höhere zellspezifische Produktivität aufwiesen. Im Zuge einer weiteren Optimierung wurde ein statistisch geplantes Screening zur Bestimmung der optimalen Induktionsbedingungen durchgeführt. Während des anschließenden Scale-Ups in den 1L-Bioreaktor-Maßstab ermöglichte die Online-Messung der dielektrischen Eigenschaften der Zellsuspension sowie die Messung der vorliegenden Trübung eine effiziente Prozesskontrolle. Basierend darauf wurden in ersten Batch- oder Fed-Batch-Prozessen 17 bis 30 mg der AMPs produziert. Eine weitere Prozessintensivierung erfolgte durch den Wechsel zu einem TFF-basierten Perfusionsprozess. Dadurch konnte die Proteinausbeute bereits in einem sehr kurzen Pilotversuch auf 130 mg erhöht werden. Schließlich wurden die funktionellen AMPs aufgereinigt und hinsichtlich ihrer Aktivität getestet.