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48,80 €ISBN 978-3-8440-8302-6Softcover196 pages56 figures294 g21 x 14,8 cmGermanThesis
November 2021
Joel Eichmann
Screening kombinatorischer Expressionsbibliotheken zur Produktion und Sekretion rekombinanter Proteine in Escherichia coli und Vibrio natriegens
Industriell genutzte Bakterien wie Escherichia coli sind einfach genetisch zu verändern, haben geringe Ansprüche an die Kultivierungsbedingungen und produzieren die meisten rekombinanten Proteine in hoher Ausbeute. Manche Proteine jedoch werden in Bakterien gar nicht oder nur in unlöslicher Form produziert. In diesem Fall kann das Zielprotein mit Fusionspartnern exprimiert werden, welche die Löslichkeit verbessern. Da nicht jeder solche Fusionspartner für jedes Zielprotein geeignet ist werden Expressionsscreenings durchgeführt, um die beste Kombination an Fusionspartnern und regulatorischen Elementen zu identifizieren. Aufgrund der hohen Zahl an Kombinationen ist der Klonierung und Analyse solcher Expressionsbibliotheken aufwändig.
In dieser Arbeit wird eine neue Methode zur Erstellung kombinatorischer Expressionbibliotheken demonstriert. Hierbei wurden die Kombinationen nicht einzeln, sondern als Pools aus Plasmiden kloniert. Die besten Kombinationen wurden anschließend mittels FACS separiert. Expressionsbibliotheken mit je 200 verschiedenen Kombinationen aus ribsomalen Bindestellen, Sekretionssignalpeptiden und Fusionspartner für Affinitätschromatografie wurden generiert und das Screening in E. coli und Vibrionatriegens, dem am schnellsten wachsenden bekannten Organismus, durchgeführt.
Als Zielproteine dienten die antimikrobiellen Peptide IMPI und BR021, das antifungale Peptid Lucimycin, und das Enzym Uricase. Alle vier stammen aus Insekten und gelten als difficult to produce.
In dieser Arbeit wird eine neue Methode zur Erstellung kombinatorischer Expressionbibliotheken demonstriert. Hierbei wurden die Kombinationen nicht einzeln, sondern als Pools aus Plasmiden kloniert. Die besten Kombinationen wurden anschließend mittels FACS separiert. Expressionsbibliotheken mit je 200 verschiedenen Kombinationen aus ribsomalen Bindestellen, Sekretionssignalpeptiden und Fusionspartner für Affinitätschromatografie wurden generiert und das Screening in E. coli und Vibrionatriegens, dem am schnellsten wachsenden bekannten Organismus, durchgeführt.
Als Zielproteine dienten die antimikrobiellen Peptide IMPI und BR021, das antifungale Peptid Lucimycin, und das Enzym Uricase. Alle vier stammen aus Insekten und gelten als difficult to produce.
Keywords: Expressionsbibliothek; Vibrio natriegens; rekombinante Proteine
Schriftenreihe des Institutes für Bioverfahrenstechnik und Pharmazeutische Technologie
Edited by Prof. Dr.-Ing Peter Czermak, Gießen
Volume 21
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